Χρωματογραφία

Η χρωματογραφία (αγγλ.: chromatography) είναι χημική αναλυτική τεχνική διαχωρισμού ουσιών από μείγμα τους. Ονομάστηκε έτσι επειδή αρχικά χρησιμοποιήθηκε για διαχωρισμό εγχρώμων ουσιών .

Αρχή λειτουργίας

Η χρωματογραφία είναι μια τεχνική στην οποία το δείγμα τοποθετείται στην μία άκρη ενός υλικού προσρόφησης που ονομάζεται ακίνητη (στατική) φάση. Στην συνέχεια αυτό εκλούεται (ξεπλένεται) από την κινητή φάση (έναν διαλύτη ή ένα αέριο), η οποία κινείται προς την άλλη άκρη της ακίνητης φάσης. Όσες ουσίες είναι πολύ διαλυτές στην κινητή φάση και προσροφώνται λίγο από την ακίνητη φάση "τρέχουν" πρώτες, ενώ όσες προσροφώνται ισχυρά κινούνται πιο αργά. Το αποτέλεσμα είναι ο διαχωρισμός τους.

Είδη χρωματογραφίας

Χρωματογραφία στήλης

Χρωματογραφία στήλης. Στην πρώτη στήλη το δείγμα μόλις έχει τοποθετηθεί. Στην δεύτερη μόλις έχει αρχίσει η έκλουση (και ο διαχωρισμός). Στην τρίτη ο διαχωρισμός είναι τέλειος

Είναι η πρώτη ιστορικά χρωματογραφία που έγινε. Κατ΄ αυτήν, μία στήλη (σωλήνας) είναι γεμάτη με κατάλληλο για τον επιθυμητό διαχωρισμό προσροφητικό υλικό (τα συνηθέστερα είναι η γέλη πυριτίου και η αλουμίνα), τοποθετημένη κάθετα. Στο άνω μέρος της στήλης τοποθετείται το δείγμα και ακολουθεί έκλουση: Κατάλληλα επιλεγμένος διαλύτης τοποθετείται στο πάνω μέρος της στήλης και όπως ρέει προς τα κάτω εκλούει το δείγμα. Έτσι μέσα στη στήλη επιτελείται διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, τα οποία είναι ορατά σε χρωματιστές ζώνες (εξ ου και το όνομα χρωματογραφία), εφόσον βέβαια τα συστατικά είναι έγχρωμα. Αν δεν είναι έγχρωμα, ο διαχωρισμός είναι εξίσου καλός, αλλά επειδή δεν είναι ορατά με το μάτι χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές για να τα "δει" ο αναλυτής(π.χ. αν φθορίζουν στο υπεριώδες φως τα φωτίζει με τέτοιο, οπότε έχουμε φθορίζουσες ζώνες). Εξέλιξη της χρωματογραφίας στήλης είναι η χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή απόδοσης (HPLC - High pressure (performance) liquid chromatography), στην οποία χρησιμοποιείται ο ακόλουθος ηλεκτρονικός/μηχανολογικός εξοπλισμός: Μία αντλία πιέζει τον διαλύτη προς την στήλη (στην απλή χρωματογραφία, ο διαλύτης ρέει με την δύναμη της βαρύτητας)με πιέσεις τάξεως μερικών χιλιάδων psi. Το έκλουσμα περνά στην συνέχεια μέσα από ανιχνευτή, ο οποίος μετρά συνεχώς είτε τον δείκτη διαθλάσεως του υγρού, είτε την ειδική απορρόφηση (φασματοφωτόμετρο) είτε άλλο χαρακτηριστικό με άλλη διάταξη (φθορισμόμετρο, φασματοφωτόμετρο μάζας,αγωγιμόμετρο κλπ) το οποίο παρέχει ένα σήμα σε ένα καταγραφικό. Το καταγραφικό καταγράφει το σήμα (είτε απευθείας είτε μέσω υπολογιστή) με τη μορφή που υπάρχει στη σχετική απεικόνιση. Ακριβώς λόγω της υψηλής πιέσεως, η HPLC είναι ταχύτατη (παρέχει αποτέλεσμα σε μερικά λεπτά της ώρας) και επειδή χρησιμοποιούνται λεπτόκοκκα υλικά προσρόφησης (λίγα μικρόμετρα) έχει μεγάλη ικανότητα διαχωρισμού.

Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (Ίδια ακριβώς όψη έχει και το χρωματογράφημα χάρτου). Εδώ εντός του κύκλου (κάτω) είχε γίνει η εναπόθεση του δείγματος(εκχύλισμα φυτικών χρωστικών). Μετά την ανάπτυξη του διαλύτη (από κάτω προς τα πάνω)έχουν ξεχωρίσει αρκετές έγχρωμες στιβάδες. Οι πλησιέστερες προς το σημείο εναπόθεσης είναι καροτένια(κίτρινες)και έχουν μικρό Rf , οι πιο απομακρυσμένες χλωροφύλλες(πράσινες) και έχουν μεγαλύτερο Rf).

Χρωματογραφία χάρτου

Είναι η πιο απλή μορφή χρωματογραφίας. Στην άκρη από ένα κομμάτι χαρτί (ακίνητη φάση) τοποθετείται μια κηλίδα δείγματος. Το χαρτί βυθίζεται στον κατάλληλο διαλύτη (κινητή φάση) από την μεριά της κηλίδας, και όπως το χαρτί διαποτίζεται σιγά-σιγά από το διαλύτη, εκλούονται τα συστατικά του δείγματος και γίνεται διαχωρισμός. Και εδώ επίσης μπορούν να εμφανιστούν "αόρατες" ουσίες που διαχωρίστηκαν με ψεκασμό (ή διαβροχή) με κατάλληλα αντιδραστήρια. Ο λόγος της απόστασης που διήνυσε η κάθε ουσία προς την απόσταση που διήνυσε ο διαλύτης (Rf), για κάθε σύστημα υλικού προσρόφησης-διαλύτη-θερμοκρασίας είναι φυσική σταθερά για την κάθε ουσία. Παράδειγμα: Αν με διαλύτη εξάνιο - ισοπροπανόλη 5:1, ξηρό χαρτί Whatman No1 και θερμοκρασία 25 βαθμούς Κελσίου μία ουσία έχει Rf 0.55, αυτό σημαίνει ότι αν ο διαλύτης κινηθεί 10 εκατοστά, η ουσία θα μετακινηθεί 5,5 εκατοστά. Αν κινηθεί 20 εκατοστά, η ουσία θα μετακινηθεί 11 εκατοστά κ.ο.κ. Δηλαδή αναπτύσσοντας ένα χρωματογράφημα, μπορούμε να εκτιμήσουμε και ποιες ουσίες είναι αυτές που διαχωρίστηκαν. Είναι σύνηθες επειδή ακριβώς μπορεί από πείραμα σε πείραμα κάποιες συνθήκες να διαφέρουν ελάχιστα (π.χ. Το χαρτί να έχει απορροφήσει λίγη υγρασία, ή να έχει εξατμιστεί λίγο εξάνιο από τον διαλύτη, οπότε η αναλογία δεν είναι πια 5:1), αλλά να έχουν μεγάλη επίδραση στο Rf, παράλληλα με το δείγμα, στο ίδιο χαρτί, "τρέχουν" πρότυπες ουσίες (τοποθετήται μια κηλίδα τους δίπλα στην κηλίδα του δείγματος και μετά αναπτύσσεται το χρωματογράφημα). Μετά την ανάπτυξη, όσο έχει μετακινηθεί η πρότυπη ουσία, τόσο πρέπει να έχει μετακινηθεί και η μελετώμενη ουσία του δείγματος. Δηλ. ουσιαστικά προσδιορίζεται το Rf για τις συνθήκες του συγκεκριμένου πειράματος. Βλέπε και σχετική φωτογραφία από χρωματογραφία λεπτής στιβάδας.

Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC)

Είναι ανάλογη της χρωματογραφίας χάρτου(βλέπε σχετικά) , αλλά αντ´αυτού χρησιμοποιείται λεπτή στιβάδα προσροφητικού υλικού που στηρίζεται πάνω σε λεία επιφάνεια (συνήθως οξείδιο πυριτίου ή αλουμίνα πάνω σε γυάλινη πλάκα). Έχει πολύ καλύτερη ικανότητα διαχωρισμού από την χρωματογραφία χάρτου. Επίσης επιτρέπει την εμφάνιση "αόρατων" ουσιών με πολύ πιο έντονα μέσα (π.χ. διαβροχή με θειικό οξύ - κάτι που θα κατέστρεφε το χαρτί).

Αέριος χρωματογραφία (GC)

Σε αυτήν η κινητή φάση είναι αέριο και η όλη οργανολογία είναι αρκετά πολύπλοκη. Το δείγμα εισάγεται σε ένα χώρο που αεριοποιείται άμεσα. Αυτό σημαίνει ότι όλα τα συστατικά του δείγματος πρέπει να μπορούν να αεριοποιηθούν, γεγονός που περιορίζει το είδος των δειγμάτων που μπορούν να αναλυθούν με την τεχνική αυτή. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι ενώσεις του δείγματος μπορούν να μετατραπούν σε πτητικές με παραγωγοποίηση. Το αέριο πλέον δείγμα παρασύρεται μέσα σε μια στήλη που περιέχει ένα προσροφητικό υλικό, οπότε γίνεται ο διαχωρισμός. Έτσι από την άλλη άκρη της στήλης εξέρχονται με τη σειρά τα διαχωρισθέντα συστατικά. Από εκεί οδηγούνται στον ανιχνευτή (ηλεκτρονικό μέρος) ο οποίος στέλνει ένα σήμα σε ένα καταγραφικό ανάλογα με την ένταση ανίχνευσης. Πετυχαίνει πάρα πολύ καλούς διαχωρισμούς, ενώ η ικανότητα ανίχνευσης των αναλυόμενων συστατικών είναι πολύ μεγάλη (φτάνει και μερικά τρισεκατομυριοστά του γραμμαρίου (pg) σε κάποιες περιπτώσεις - συνήθως είναι σε μερικά δισεκατομυριοστά (ng))

Χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography - HPLC)

Όπως και η χρωματογραφία στήλης, στην HPLC ο διαχωρισμός πραγματοποιείται καθώς εκλούεται το δείγμα με την βοήθεια υγρής κινητής φάσης από στήλη γεμάτη με την ακίνητη φάση σε μορφή στερεών κόκκων. Όμως επειδή η ακίνητη φάση βρίσκεται στη μορφή πολύ λεπτών κόκκων η κινητή φάση διέρχεται από την στήλη με την βοήθεια αντλίας. Η χρήση της αντλίας αυξάνει την πίεση στο εσωτερικό της στήλης, εξού και το αρχικό όνομα της τεχνικής αυτής (high pressure liquid chromatography). Οι ενώσεις του δείγματος ταυτοποιούνται και βρίσκεται η συγκέντρωση τους με την βοήθεια κάποιου ανιχνευτή.

HPLC κανονικής φάσης

Σε αυτή την περίπτωση ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται γέλη πυριτίου (silica gel), ένας μη πολικός διαλύτης ως κινητή φάση π.χ. εξάνιο.

HPLC αντίστροφης φάσης

Είναι το είδος HPLC με τις περισσότερες εφαρμογές. Ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται γέλη πυριτίου που στην επιφάνεια του έχουν προστεθεί αλειφατικές ομάδες (συνήθως ευθείες αλυσίδες -(CH₂)₁₇CH₃ ) που καθιστά την ακίνητη φάση υδρόφοβη. Αντίστοιχα, ως κινητή φάση επιλέγεται ένας πολικός διαλύτης π.χ. μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο.

Χρωματογράφημα από καταγραφικό.Το συγκεκριμένο είναι από HPLC (προσροφητικό υλικό ιονανταλλακτική ρητίνη). Κάθε έξαρση (peak)προέρχεται από διαφορετική ουσία, και η επιφάνειά του είναι ανάλογη προς την ποσότητα της ουσίας. Στον άξονα χ-χ΄ο χρόνος έκλουσης, και στον ψ-ψ΄ η ένταση του σήματος από τον ανιχνευτή. Παρόμοια είναι και τα χρωματογραφήματα της αέριας χρωματογραφίας

Πηγές

• Λάζος Ε., Μπρατάκος Μ., Φυσικοχημικές μέθοδοι ανάλυσης
• Πολυχρονιάδου Α., Ανάλυση τροφίμων
• Ηλιόπουλος Γ., Εργαστ. ασκήσεις οργανικής χημείας
• Braithwaite & Smith, Chromatographic methods
• Bildingmeyer B., Practical HPLC methodology and applications
• Jork, Funk, Fisher & Wimmer, TLC